Főnemes, nagybirtokos, főispán, Temesvár főkapitánya.
A magyarországi alsó részek Temesvárott székelő főkapitányainak tisztsége nem szűnik meg a mohácsi ütközetet (1526) követően. Az 1530-as évekig I. Ferdinánd császár pártján többen töltötték be a főkapitányi tisztséget, például Perényi Péter (1526-1527) és Török Bálint (1528-1530), de 1541-től már I. Szulejmán szultán hűbéreseként Petrovics Péter viselte azt.
Losonczy 1542-ben Perényi Péterrel, Joachim őrgróf parancsnoksága alatt, a Pestet ostromló seregben harcol. Eleinte Szapolyai János pártján áll, ezért I. Ferdinánd több ízben vádat emel ellene. Miután 1547-ben kegyelmet kap, Nógrád megye főispánja lesz. Ezt úgy igyekszik meghálálni Ferdinándnak, hogy Báthory Andrással, Nádasdy Tamással és Gian Battista Castaldo-val Erdélybe indulnak, hogy megszerezzék azt a Habsburg birodalom számára. 1550-ben része van abban, hogy a török Szolnokon várat ne építhessen, illetve a vár építését a magyarok fejezhessék be.
1540 körül feleségül veszi Országh László özvegyét, Pekry Annát. A házasságból két leánygyermek születik: Fruzsina és Anna, Balassi Bálint költő szerelme. Halála után I. Ferdinánd a Losonczy-lányokat fiúsította. Fruzsina Báthory Miklós országbíróhoz, Anna Ungnád Kristófhoz, a későbbi horvát bánhoz megy feleségül.
Fráter György „országegyesítési” akciója során, 1551 nyarán kerül Temesvár ismét a Habsburg uralkodó kezébe. Losonczy ekkor veszi át a vár és a hozzá tartozó, a vár szűkebb környezetére apadt keresztény fennhatóság alatt álló terület vezetését. Sok csapást mért a délvidéken portyázó törökre, könnyűszerrel visszaveri Mohamed beglerbég első ostromát.
Az 1552. március 30-án Pozsonyban letett főkapitányi esküjének szövege megmaradt az utókorra, a Magyar Országos Levéltár őrzi Budapesten: Juramentum Stephanus de Lossonczij de officio Comitis Themesiensis et Capitaneatus generalis partium inferiorum regni Sacratissimae Maiestatis Regiae, praestitum Posonii tricesima Martii, anno domini quo supra. [ti.1552-ben]. Losonczy arra esküszik, hogy a temesvári várat és várost (Arcem et civitatem Themesiensem) hűséggel szolgálja.
Az újonnan kinevezett főkapitány 1000 lovas és 500 gyalogos felett parancsnokolt, melyek közül 500 lovas és 300 gyalog közvetlenül Temesvár védelmét biztosította. Megerősítteti a város északi kőfalait. A fal belső oldalán földből erős védőművet (trincea) készíttet, amely az észak-nyugati bástyára támaszkodik és benne gyalogos lövészek számára fedett lőállások és a védőmű belsejében bombamentes kazamaták vannak. A falon kívül pedig a középen álló kapu és egyik tornyos körbástya közé, megfelelő mélységű cölöpművet készített, hogy a kőfal minden oldalról megvédhető legyen.
1551 júniusában a Temesvár alá érkező török előcsapatot megtámadja s elűzi; a derékhaddal előnyomuló Szokollu Mehmed ruméliai beglerbég októberben eredménytelenül ostromolja a várat. Losonczy 1552 júniusában temesi ispánként országos részgyűlést tart Simándon (Zaránd vármegye) Temesköznek a közeledő török sereg elleni védelméről.
A törökök 1552-ben ismét ostrom alá veszik Temesvárt, az ostromló hadat élén ezúttal Ahmed pasa másodvezír áll. A vár védőinek száma 2200: 1300 magyar, 500 spanyol, 300 cseh és német vitéz. A törökök százezer katonával támadnak a várra. Losonczy segélyt kér: Castaldótól, Báthory Endre vezértársától, Varkócz vezértől, ha egyéb segítséget nem, legalább lőport küldjenek neki. A Báthory és Losonczy családok közötti ellenségeskedés miatt Báthory nem is válaszol, Castaldo küld lőport; de azt Bernardo de Aldana zsoldosvezér Lippán lefoglalja. Mivel felmentő seregre nem számíthatott, megkéri feleségét, adja zálogba birtokaikat és ezen a pénzen próbáljon felmentő erőket szerezni. A Tóth Mihály szegedi bíró vezetésével érkező 1700 fős csapat Szentandrás mellett vereséget szenved. Rövid idő múlva a temesvári piacon a házak romokban hevernek, a várban pedig a Hunyadi-várkastély szenved nagyobb károsodást, itt van Losonczy lakása is. A pasa ajánlatot tesz Losonczynak, hogy seregestől elvonul a vár alól, ha ő kieszközli a Petrovics Péter által a szultánnak fizetett összeget. Ajándékokkal való megvesztegetéssel is próbálkozik, de Losonczy kijelenti, „… inkább tízszer hal meg, mint sem az áruló nevet magára vegye.” A vár állandó ágyúzása következtében július 24-én már a falak és bástyák a támadás vonalában az alap síkjáig le voltak rombolva. A leomlott falak törmeléke a vár vizes árkait feltöltötte és átkelésre járhatóvá tette. A törökök általános rohamot intéztek a vár ellen, az egyiket a Szigetváros felől a déli kapura, a főtámadást pedig a Vízi-toronyra. A roham kora délután kezdődött és megállás nélkül öt órán át folyt. Elkeseredett harc után a janicsárok a Vízi-toronyra felkapaszkodva kitűzték a lófarkas félholdat.
A német-cseh-spanyol zsoldosok készek átadni a várat a töröknek. Losonczy várkapitány enged a katonák nyomásának. Ahmed pasa a védőknek szabad elvonulást ígér, de ígéretét megszegve seregével a kivonuló katonákra támad. A vár kapitánya és a katonák hősiesen védekeznek, sokan elesnek, másokat elfognak és rabságba hurcolnak. A sebesült Losonczyt elfogják. Ahmed lefejezteti, fejét elküldi Konstantinápolyba.
Tinódi (Lantos) Sebestyén az ostrom után 3 héttel megénekeli a hős tetteit: Az vég Temesvárban Losonczi István haláláról.
